生化实验讲义(终极笔记)

生化实验讲义(终极笔记)

生化实验讲义(理论部分)1

常感谢原作之专家!〔Ⅰ〕 理论部分1. 绪论   
欢迎同学们到生物化学实验室来！对于大多数学生来说，这不是第一次做化学实验，但是我们相信，生物化学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的、在生物化学的科学研究中最常用的实验方法。同学们在生物化学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。   
当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出“克”数量级的产物。同学们将进行的是“毫克”和“微克”数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的生物化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到“眼睛”的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。同学们通过生物化学实验应该做到：⑴
学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。⑵
训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。⑶
学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。⑷
掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。   
预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！1.1
生物化学实验技术发展简史   
生物科学在20世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。   
20年代：
微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000×g（5000
r/min～8000
r/min）相对离心力的超离心机(相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”)，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。   
30年代：
电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。     40年代：
层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。   
“电泳技术”是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。   
50年代：
自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。   
60年代：
各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。   
1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析,
Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。   
此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968?1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。   
70年代：
基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。   
80至90年代：
基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。      
1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。   
1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。     
1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase
Chain
Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。   
除上述历史以外，还可以列出许多生物化学发展史上的重要成就，例如：   
美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。   
美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。   
英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。   
英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。     
1959年，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。   
美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。   
法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。   
1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。   
1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。   
1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。   
1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。   
1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40～70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。   
我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。   
由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。1.2
实验室规则    ⑴
实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。    ⑵
实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。    ⑶
实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。   
⑷
实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。   
⑸
配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。   
⑹
配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。   
⑺
配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。    ⑻
使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和ＨＰＬＣ等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。   
⑼ 实验室内严禁吸烟、饮水和进食，
严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。   
⑽
实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。    ⑾
每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。   
⑿
每位学生要熟悉实验室内电闸的位置，烘箱和电炉用毕必须立即断电，不得过夜使用， 要严格遵守实验室安全用电规则和其他安全规则。    ⒀
每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。1.3
实验室安全及防护知识   
在生化实验室中可以说是“五毒”俱全，即着火、爆炸、中毒、触电和割伤的危险均时刻存在。因此每一位在生化实验室工作的人员都必须有充分的安全意识，严格的防范措施和丰富实用的防护救治知识，一旦发生意外能正确地进行处置，以防事故进一步扩大。1.3.1
着火   
生化实验室经常使用大量的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而实验室又经常使用电炉等火源，因此极易发生着火事故。常用有机溶剂的易燃性列表如下：              
表1?1  常见有机液体的易燃性     名    称      沸  点/℃           闪
点※/℃        自燃点※※/℃     乙    醚        34.5              －40              
180     丙    酮        56                －17              538     
二硫化碳        46                －30              100           苯         
80                －11     乙醇（95％）    78                  12               
400              ※
闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。     ※※ 自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。   
由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。   
预防火灾必须严格遵守以下操作规程：   
⑴严禁在开口容器和密闭体系中用明火加热有机溶剂，只能使用加热套或水浴加热。   
⑵废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道。   
⑶不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。   
⑷在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。   灭火方法：   
实验室中一旦发生火灾切不可惊慌失措，要保持镇静，根据具体情况正确地进行灭火或立即报火警（火警电话119）。   
⑴容器中的易燃物着火时，用灭火毯盖灭。因己确证石棉有致癌性，故改用玻璃纤维布作灭火毯。   
⑵乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。   
⑶导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用1211灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。   
⑷个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。1.3.2
爆炸生物化学实验室防止爆炸事故是极为重要的，因为一旦爆炸其毁坏力极大，后果将十分严重。生物化学实验室常用的易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限（体积％）见表1?2。   
加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物～氧化铜、 浓硫酸～高锰酸钾、
三氯甲烷～丙酮等。   
常见的引起爆炸事故的原因有：①随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。               
②在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。 ③在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器
，或反应过于激烈而失去控制。 ④易燃易爆气体大量逸入室内。 ⑤高压气瓶减压伐摔坏或失灵。                           
表1?2  易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限                   名  称   
爆炸极限（体积百分数）   名  称   爆炸极限（体积百分数）          乙醚      
1.9～36.5               丙酮       2.6～13     甲醇       6.7～36.5               
乙醇       3.3～19     氢气       4.1～74.2               乙炔      
3.0～82  1.3.3 中毒   
生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴乙锭等。    剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈
、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。    中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。   
中毒的预防：
①保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行。 ②取用毒品时必须配戴橡皮手套。  
③严禁用咀吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋。
④不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。     
中毒急救的方法主要有：①误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服Mg(OH)2乳剂，最后饮些牛奶。②吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法。③
砷和汞中毒者应立即送医院急救。1.3.4 外伤    ⑴ 化学灼伤：      
①眼睛灼伤或掉进异物：眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗十五分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。若有玻璃碎片进入眼内则十分危险，必须十分小心谨慎，不可自取，不可转动眼球，可任其流泪，若碎片不出，则用纱布轻轻包住眼睛急送医院处理。若有木屑、尘粒等异物进入，可由他人翻开眼睑，用消毒棉签轻轻取出或任其流泪，待异物排出后再滴几滴鱼肝油。      
②皮肤灼伤：      
(a)酸灼伤：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。      
(b)碱灼伤：先用大量水冲洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。      
(c)溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用20％硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。   
⑵烫伤：使用火焰、蒸汽、红热的玻璃和金属时易发生烫伤，应立即用大量水冲洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上纱布后就医，轻度烫伤可涂抹鱼肝油和烫伤膏等。   
⑶割伤：   
这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，切不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，就医时务必检查伤部神经是否被切断。   
实验室应准备一个完备的小药箱，专供急救时使用。药箱内备有：医用酒精、红药水、紫药水、止血粉、创口贴、烫伤油膏（或万花油）、鱼肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氢钠溶液、20％硫代硫酸钠溶液、医用镊子和剪刀、纱布、药棉、棉签、绷带等。1.3.5

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