本帖最后由 花仙子2008 于 2013-1-6 19:35 编辑
动物细胞的一种氧化还原酶在大肠杆菌中的表达 与在细胞中的定位（实验设计方案与讨论）
为数不少的参加考研考博的同学对于实验设计类生物科学类的试题（尤其是生物化学与分子生物学的实验设计试题）都觉得比较不爽，甚至于无奈。
回答生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学或者生物物理学等的实验问题基本的原则要先懂得一些基本的本学科的实验原理，不一定也不可能逐一去做，但是要大概知道一些最基本的试验方法和技术。另外，参照一些具体的实验问题的解答也是有帮助的，但是很遗憾的是目前的大陆的生物化学、分子生物学、细胞生物学、微生物学或者生物物理学等的教材或者对应的习题和试题解答都没有给予这方面的训练以应有的重视，以至于不仅导致同学们在参加考研考博时遇到此类实验设计试题时感觉不爽，而且往往到此后的读研读博和从事科研工作时也还会因为具体设计实验课题而不爽。
下面举例说明。发在这里仅仅是通过这个例子给各位看一下思考实验设计问题的大致的较为完整的步骤和思路。这是具体的实验课题设计，考研一般考不到如此难度（各位不要害怕），考博有可能考到如此难度，对考博生物化学与分子生物学这样考也是10分以上的压轴题。再说一遍，这个问题是硕士生或博士生的实验课题的设计，不是考研试题，看到后不要惊慌，只是空闲时扫一眼知道实验设计也不过如此，并非高不可及！再有就是能够理解：具体的科研课题的实验设计也必须要以基础知识为逻辑起点和具体工具。
题目：用大肠杆菌表达来源于动物细胞的某一氧化还原酶；并利用免疫荧光技术对细胞中的该蛋白进行定位。
答：这问题由我本人设计实验（方法还有很多种，我没有都写出来），但不是我的实验课题，是我在2012年的最后一天的晚上在“百度知道”（偶尔去了一趟）回答内蒙古大学某人的一个实验设计问题，可我刚回答完，原问题就被撤消了（⊙﹏⊙b汗）。答案不是唯一的（疏漏之处欢迎斧正）。
这不难设计。
第一步，获得来源于动物细胞的某一氧化还原酶的基因并且将其导入大肠杆菌。
这就是分离基因，化学合成，cDNA文库，mRNA筛选（比如DDRT，RDA，mRNA差异显示技术,削减杂交等），鸟枪法分离基因等等；然后导入载体（质粒，用表达载体好一些，因为先把载体DNA整合到大肠杆菌的基因组不太容易，整合进去高表达还要费不少事情）；再将载体导入大肠杆菌细胞（比如氯化钙制备感受态大肠杆菌，使其转化载体进入其细胞），一般在其基因之前加上强启动子。这步还包括阳性克隆筛选和分离，大规模培养，产品收获就算了，不要粉碎细菌，也不要构成分泌蛋白质，就让目的基因表达的蛋白质留在大肠杆菌细胞里。这一步就是完全依据基因工程的进本步骤而设计。
第二步，获得抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体。
单抗的制备方法，最粗糙的方法：小鼠腹水法。其实用多克隆抗体也可以，只是效果差一些。
第三步，，给单克隆抗体标记上可以发出荧光的基团。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。这一步也下一步密切信关，做得好下一步可以省很多事情。当然也可以给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之间共价键链接，但是比较麻烦。
第四步，将用免疫荧光基团标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体进入大肠杆菌细胞中。
给把单克隆抗体的基因偶联上绿色荧光蛋白的基因在大肠杆菌中一同表达，两者之间共价键链接，首先还要要把抗一种将抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体的基因分离出来导入大肠杆菌这也是一种实验方法，不过构建基因，联入DNA载体，导入细胞，阳性克隆筛选，工作量可不小，我是不这样实验的，时效比太低。
还有其他的更简单的实验方法：直接从蛋白质水平动手。从外界导入带有荧光标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体蛋白质，这又可以有好多种办法：一种显微注射法，对实验人员的操作水平要求推高，而劳动量大，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干）；第二种方法让细胞内吞摄入蛋白质，然后把抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体一起拉入细胞（去查一下大肠杆菌内吞哪些蛋白质），当然要把大肠杆菌内吞蛋白质与抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体共价链接在一起。怎么连？再做个融合蛋白的基因去表达出来？那多累呀，像我这样的懒人绝对不干（给钱也不干），谁像这样实验谁就去做，反正我绝对拒绝如此实验（不当低水平劳动力），可用分子交联方法-------用有机试剂把两者用化学反应偶联到一起不就行了吗，有空间位阻，加个链接臂行了吧，比如可以先用EDC、戊二醛等试试看，去查一下与抗体工程和酶的固定化相关的Methods inMolecular Biology ，Methods in Enzymology系列的实验手册。分子交联方法当然会出很多的混合物，用层析筛选一下，在检测一下活性，适当控制和调整反应试剂和反应条件，得到阳性结果不难。荧光从哪来？给偶连蛋白质标记上能够发出荧光的有机染料分子不就行了。或者也可以直接使用量子点荧光法，量子点本身也就是靠其偶联的抗体在细胞内定位的。量子点制备与实验方法的原理与步骤可以参见Methods in Molecular Biology Vol-374-Quantum Dots。
第三步和第四步实际上很难说谁先谁后，我是为了说明清楚人为分开的。
第五步，单抗与来源于动物细胞的某一氧化还原酶（抗原）相互作用。
抗原与抗体相互作用并不困难，但是在细胞中要注意必须使得两者在同一个亚细胞区室中。因为这题是在大肠杆菌中，没有细胞器，也就不必再给当克隆抗体连接上进入各个封闭性的细胞器的信号肽序列，比如进入线粒体或者叶绿体或溶酶体等特异性信号肽序列。如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位，那么这步实际上就省略了；如果原问题问的是确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细胞中的具体部位，那么给单抗的氨基端接上信号肽或者信号斑（后者不在氨基端）可能就是需要的（第六步再解释为什么即使对于真核的动物细胞也不是必须要给单抗接上信号肽和信号斑）。给单抗接上信号肽和信号斑用融合蛋白当然是可行的，但是工作量又大了，有没有更爽的试验方法？当然有！请看第六步， 第六步，确定大来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞和在原来表达它的动物细胞中的具体部位（原题没有说清楚，所以对两种细胞都要讨论）。
1.确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。给予大肠杆菌细胞外界光源，使导入的荧光基团发出特异性波长的荧光，用荧光显微镜直接观察荧光所在细胞的亚细胞部位，并拍照可确定大肠杆菌表达的来源于动物细胞的某一氧化还原酶在大肠杆菌的细胞的具体部位。
2.确定来源于动物细胞的某一氧化还原酶在原来表达它的动物细胞内的具体部位。按第五步构成融合蛋白质当然是可以的，但是等于把第一步的工作有对抗源于动物细胞的某一氧化还原酶的基因基本上又重复了一遍，工作量大也没有太大必要。但是在氨基端共建连接上一段信号肽，用有机合成合成方法（比如用EDC催化氨基与羧基缩水构成新的肽键，虽然副反应不少，但是反应条件温和，效率高，用层析分离收获到所需产品并不难，可是信号斑在肽段中间，再用有机合成先切开再插入信号斑序列，然后还要连接，每一步都有副反应，每一步都要分离提纯，还涉及到重折叠，即使能够做成，劳动量比融合蛋白绝对不小。 那怎么办？既然困难很大，那么就另辟蹊径，从别的实验途径达到目的。做好了有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体，不再加工了；而转向加工原来表达“来源于动物细胞的某一氧化还原酶”的动物细胞本身·，将该种动物细胞粉碎，然后分级分离提纯细胞不同成分，比如离心、层析，不用太多的分离纯化，对膜性封闭细胞器还是必须能够彼此分开，因为要加以各自粉碎，膜性封闭细胞器混在一起被粉碎就不知道液相提取液的具体来源了。然后分别对于不同提取液加入有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗体，进行免疫沉淀。发生沉淀后收集免疫沉淀物，因为可以事先用非变性分子筛层析测出单抗与目的酶混合物的相对分子量，再给予不同提取液加入有荧光染料标记的抗来源于动物细胞的某一氧化还原酶的单克隆抗与其抗原的复合物给予外界光源，使单抗偶联的荧光染料发出特定波长的荧光，进而用荧光显微镜观测，是阳性结果的提取液是目地酶的来源的亚细胞定位处。如果免疫沉淀物中的荧光有机染料不能够有效吸收外界光源并且激发荧光，可以适当加入中性盐溶液，比如氯化钠，拆解开免疫复合物，并适当稀释。因为有荧光显微镜的直接观测，所以免疫沉淀可以做的稍微比较粗糙。 实际上，还有很多种实验方法，有很多实验方法不必使用免疫荧光，可能还更加简单。 Good Luck!  | 
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