分子生物技术--染色体免疫共沉淀chip

只是一项新兴的很重要的技术，一些重点大学把它作为初试测试内容，中科院也很注重它，希望大家注意
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免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀
一 原理：
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。

每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。(待续)



Chromatin immunoprecitation（ChIP）——核酸版明星技术（二） |..
染色质免疫沉淀分析(ChiP)是基于体内分析发展起来的方法,它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其...染色质免疫沉淀分析(ChIP)是基于体内分析发展起来的方法,它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白,是目前...

英国的研究者已经设计出了一种有关染色质免疫沉淀反应的方法，它仅仅需要一百个如此少量的细胞，为我们开启了一扇大门，以便通往有关原始细胞和胚胎的表观遗传信息这一领域的研究。
    在过去十年中，染色质免疫沉淀反应(ChIP)已经成了进行表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断何种组蛋白修饰会出现在细胞核中基因组的某一特定位置。它的原理很简单：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。该组蛋白标记是对组蛋白尾端的一种后翻译修饰过程。一同沉淀下来的DNA接着能通过PCR或者杂交法加以分析。

    尽管这种技术非常流行，但它的缺点之一就是需要大量的启动材料，通常是一千万个细胞。“你要受到ChIP的很大限制，这是一个公认的问题。你能使用细胞系来进行研究，但通常无法使用原始细胞，”英国伯明翰大学医学院的Bryan Turner如是说。两年前，因为受制于这一问题的困扰，Bryan Turner和他长期共事的同事Laura O''''Neill开始着手解决这一问题。他们猜想，主要问题将是如何在每一步骤中对程序的效率进行最优化处理。防止材料的丢失和获取高质量的染色质将是至关重要的。因此，他们将源于另一物种的染色质作为载体，试图利用它将小鼠的染色质样品进行“膨胀”处理；因此，载体ChIP被创造了出来。

    “它的概念非常之简单，效果也非常之好，”O''''Neill说。他使用苍蝇的SL2型细胞作为载体染色质的源，很快就成功地将启动材料所需要的量降低到一万个细胞，然后再到一千个细胞。为什么在那里停了下来？由于在对程序的优化过程中获得了快速成功，受其鼓舞，这对研究伙伴开始试图想回答更为大胆、更为有挑战性的问题。当胚胎学专业的研究生Matthew VerMilyea来到这个实验室时，所要解决的挑战问题就变得明确了：他们能在早期的胚胎中观察到组蛋白标记吗？

    “大约花费了至少一年的时间，”Turner回忆说，“因为我们的目标是要达到非常少量的细胞，比我们曾经试图要获得的量还要少。”在七月份出版的《自然-遗传学》上，该研究小组报告了他们如何成功地仅仅使用50-100细胞，就能够可靠地进行这些试验，这50-100个细胞采集于三个胚胎的胚囊内细胞团。在小鼠干细胞中的Nanog、Oct4 和Cdx2这类调控基因上存在着组蛋白标记，比如说H3K9的甲基化作用和H4的乙酰化作用，他们对这些组蛋白标记的分布情况进行了观察，结果发现在胚胎的胚囊内细胞团和胚胎干细胞系之间存在着极显著的差异，这一结果也许一点也不奇怪--因为这一表观遗传信息研究项目在培养物的细胞适应过程中很可能就已经被改变了--但它对表观遗传学家来说可作为一种警示性的故事来提醒。

    导致这一技术成功的因素之一是使用了自身的ChIP(NChIP)来替代原本更为流行的XchIP。NchIP是由O''''Neill和Turner两人在上世纪九十年代帮助创立的一种草案协议。在这一方法中，蛋白质在发生免疫沉淀反应之前通过化学反应的方式与DNA发生了交联作用。化学交联作用对于观察非组蛋白型蛋白是必要的，否则在进行这些试验时它会与DNA分离开来，但它常常会在对易变性的组蛋白尾端上的抗原决定基识别时产生影响，接着会减少组蛋白免疫沉淀反应的效率。“仅仅有几个人使用NChIP”，Turner说，“但是，如果你正在观察组蛋白时，因为它的程序是非常有效率的，这样就没有使用其它任何技术的借口了。”

    当然，在能否观察非组蛋白型蛋白方面存在着很多兴趣，伯明翰大学的研究小组目前正忙于建立一个具有交联作用特征的ChIP载体程序。O''''Neill对结果表现得非常乐观，“这种方法会起作用，但需要大量的细胞--一万个或者一千个--这种量大约需要进行几次订购才能完成，但要少于运用传统的ChIP这种方式，而且它仍处于我们通过荧光激活的细胞分选技术或活组织切片技术所能获得的量级范围之内。”

    这一系统的美妙之处在于，这项新技术正重新赋予ChIP以临床相关性，而这一典型特征在过去正处于丢失过程中。如今，在一些免疫细胞小的分选种群中或者直接从病人身上获取的肿瘤切片中，可以直接观察到染色质的免疫沉淀反应。然而，看起来最使Turner的研究小组激动的是胚胎方面的工作。正如Turner所言，“早期的胚胎是典型的表观遗传信息系统，那是每件事情开始的地方，到目前为止，并没有找到观察早期胚胎中的表观遗传信息标记的方式。”运用这种新技术，他们也许已经为我们打开了一项全新的研究领域

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